loading buffer 的中文名字叫上样缓冲液,6*的缓冲液中可以显示两条带,前面的紫兰色的条带是溴酚蓝,在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中,溴酚兰的迁移率分别与1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同;后面的兰色条带是二甲苯青,它在1%和1.4%琼脂糖中电泳时,其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相似。而对于PAGE胶他们的迁移速率也分别不同。

  • 中文名

  • 上样缓冲液

  • 外文名

  • loading buffer

  • 配制量

  • 5mL

  • 配制方法

  • 5×SDS-PAGE Loading Buffer

目录
  1. 1主要用途

  2. 2制备方法

loading buffer主要用途

loading buffer的功能主要有两个。第一,里边的指示剂溴酚蓝和二甲苯氰FF起到指示的作用,显示电泳的进程,以便我们适时终止电泳;第二,里边的成分甘油可以加大样品密度,使样品密度大于TAE,从而沉降到点样孔中,防止样品飘出点样孔。另外,有的Buffer是加有SDS的,一般都会写明。SDS主要是促使聚合酶变性,因为没有除尽的聚合酶会结合在DNA双链上影响它的迁移速率。细胞裂解后的裂解液,加loading 100℃加热,也是为了中止酶促反应,防止提取的蛋白质降解。

loading buffer制备方法

6×loading buffer 一般配置:

6×Loading buffer:

30mM EDTA

36%(v/v) Glycerol

0.05%(w/v) Xylene Cyanol FF

0.05%(w/v) Bromophenol Blue

主要用于DNA电泳

10×Loading buffer:

30mM EDTA

50%(v/v) Glycerol

0.25%(w/v) Xylene Cyanol FF

0.25%(w/v) Bromophenol Blue

主要用于RNA电泳

10 X loading buffer中仅有色素溴酚蓝(Bromophenol Blue)一种染料(浓度0.05%);

6 X loading buffer中含色素溴酚蓝(Bromophenol Blue)、二甲苯腈蓝FF(Xylene Cyanol FF)两种染料(浓度都是0.05%)

在琼脂糖凝胶(0.5% ~ 1.4%)中溴酚蓝(Bromophenol Blue)约与300 bp的双链线状DNA的迁移速度相同,二甲苯腈蓝FF则与4 kbp的双链线状DNA的迁移速度相等。

6Xloading buffer是用来上样的;10Xloading buffer是stop buffer,是停止酶促反应的,如果一定要用10Xloading buffer的上样当然也可以,唯一要注意的是:10Xloading buffer中多了一样SDS,它会使酶类如taq酶变性,以PCR产物为例,在电泳泳道上会产生一片弥散,如果电泳跑的距离短,和多出来一条带没有什么区别(大概1000bp左右)。

5×SDS-PAGE Loading Buffer配制方法

组份浓度:

250mM Tris-HCl(pH6.8)

10%(W/V) SDS

0.5%(W/V) BPB

50%(V/V) 甘油

5%(W/V) β-巯基乙醇

配制量: 5mL

配制方法:

1.量取下列试剂,置于10mL塑料离心管中。

1M Tris-HCl  1.25mL

SDS  0.5g

BPB  25mg

甘油  2.5mL

2.加入去离子水溶解后定容至5mL。

3.小份(500μl/份)分装后,于室温保存。

4.使用前将25μl的2-ME加到每小份中。

5.加入2-ME的Loading Buffer可在室温下保存一个月左右

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